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ELISpot小技巧之靜置細(xì)胞

更新時間:2024-11-21   點擊次數(shù):657次

ELISpot是一種用于定量分泌某種特定靶標(biāo)分析物細(xì)胞的免疫測定方法。整個刺激過程中細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、抗體或其他靶蛋白在分泌后會立即被特異性抗體捕獲,這種即時捕獲使ELISpot成為一種在單細(xì)胞水平上極其靈敏的檢測方法。

 

細(xì)胞在刺激存在或不存在的情況下,在包被有特異性捕獲抗體的膜孔中進(jìn)行培養(yǎng),因此,細(xì)胞分泌的目標(biāo)蛋白會被立即捕獲。經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r間孵育后,取出細(xì)胞,使用檢測抗體檢測分泌的靶標(biāo)分析物。加入染色底物后,最終在膜表面上出現(xiàn)可見的斑點。每個點對應(yīng)一個單獨的分泌目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞。

ELISpot檢測示意圖

圖1.ELISpot檢測示意圖


想要做好ELISpot實驗,從最開始包被抗體到最后檢測的每個實驗細(xì)節(jié)都需要注意。大家往往可能會忽略一個細(xì)胞處理的細(xì)節(jié)步驟,即細(xì)胞靜置步驟。該步驟有可能會顯著影響ELISpot實驗的準(zhǔn)確性。下面Mabtech帶我們深入了解一下為什么細(xì)胞靜置這一步至關(guān)重要,以及如何正確完成。


ELISpot分析非常靈敏,能夠檢測到分泌靶標(biāo)分析物的單個細(xì)胞,但實際情況中有可能非實驗性體內(nèi)刺激或分離細(xì)胞過程中的攪動會使細(xì)胞自發(fā)分泌高水平的靶標(biāo)分析物,如細(xì)胞因子或抗體,導(dǎo)致檢測結(jié)果失真。ELISpot檢測前的細(xì)胞靜置步驟有助于確保細(xì)胞處于自然、未受刺激的狀態(tài),從而更準(zhǔn)確地反映其正常的靶標(biāo)分析物分泌水平。靜置細(xì)胞的另一個重要作用是去除細(xì)胞碎片,確保更干凈的背景。


如何進(jìn)行細(xì)胞靜置處理呢?

1.分離細(xì)胞:首先分離好實驗所需的PBMCs、T細(xì)胞、B細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞。

2.調(diào)整細(xì)胞密度:在分離和洗滌細(xì)胞后,測量細(xì)胞活力,并將細(xì)胞密度調(diào)整到適合靜置的水平。通常,細(xì)胞密度約為每ml培養(yǎng)基1-2百萬個細(xì)胞。Mabtech建議將細(xì)胞放在50ml或15ml的無菌錐形管中,并稍微擰松蓋子,以便在培養(yǎng)時進(jìn)行氣體交換。

3.靜置細(xì)胞:在37℃、含5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。讓細(xì)胞靜置至少一個小時,或者過夜。最佳靜置時間可能因細(xì)胞類型和檢測的具體情況而異,需要進(jìn)行一些優(yōu)化。

細(xì)胞靜置處理.png

4. 靜置期結(jié)束后,輕輕地重懸細(xì)胞,讓一些結(jié)塊的細(xì)胞碎片落到試管底部。避免結(jié)塊漂起,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一個新的50 ml試管中進(jìn)行洗滌步驟。

細(xì)胞靜置處理-1.png

5.離心洗滌細(xì)胞,倒出上清液。重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中,并重復(fù)一次洗滌步驟。

細(xì)胞靜置處理-2.png

6.  再次檢測細(xì)胞活力,并將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到ELISpot檢測所需的適當(dāng)水平。


溫馨提示:本文中的實驗步驟僅供參考,實驗時請按照產(chǎn)品說明書操作。

 

 

更多產(chǎn)品詳情請聯(lián)系Mabtech中國授權(quán)代理-欣博盛生物   


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