ELISpot小技巧之靜置細胞

ELISpot是一種用于定量分泌某種特定靶標分析物細胞的免疫測定方法。整個刺激過程中細胞分泌的細胞因子、抗體或其他靶蛋白在分泌后會立即被特異性抗體捕獲，這種即時捕獲使ELISpot成為一種在單細胞水平上極其靈敏的檢測方法。

細胞在刺激存在或不存在的情況下，在包被有特異性捕獲抗體的膜孔中進行培養，因此，細胞分泌的目標蛋白會被立即捕獲。經過適當的時間孵育后，取出細胞，使用檢測抗體檢測分泌的靶標分析物。加入染色底物后，最終在膜表面上出現可見的斑點。每個點對應一個單獨的分泌目標蛋白質的細胞。

圖1.ELISpot檢測示意圖

想要做好ELISpot實驗，從最開始包被抗體到最后檢測的每個實驗細節都需要注意。大家往往可能會忽略一個細胞處理的細節步驟，即細胞靜置步驟。該步驟有可能會顯著影響ELISpot實驗的準確性。下面Mabtech帶我們深入了解一下為什么細胞靜置這一步至關重要，以及如何正確完成。

ELISpot分析非常靈敏，能夠檢測到分泌靶標分析物的單個細胞，但實際情況中有可能非實驗性體內刺激或分離細胞過程中的攪動會使細胞自發分泌高水平的靶標分析物，如細胞因子或抗體，導致檢測結果失真。ELISpot檢測前的細胞靜置步驟有助于確保細胞處于自然、未受刺激的狀態，從而更準確地反映其正常的靶標分析物分泌水平。靜置細胞的另一個重要作用是去除細胞碎片，確保更干凈的背景。

如何進行細胞靜置處理呢？

1.分離細胞:首先分離好實驗所需的PBMCs、T細胞、B細胞或其他免疫細胞。

2.調整細胞密度:在分離和洗滌細胞后，測量細胞活力，并將細胞密度調整到適合靜置的水平。通常，細胞密度約為每ml培養基1-2百萬個細胞。Mabtech建議將細胞放在50ml或15ml的無菌錐形管中，并稍微擰松蓋子，以便在培養時進行氣體交換。

3.靜置細胞:在37℃、含5% CO2的無菌培養箱中培養細胞。讓細胞靜置至少一個小時，或者過夜。最佳靜置時間可能因細胞類型和檢測的具體情況而異，需要進行一些優化。

4. 靜置期結束后，輕輕地重懸細胞，讓一些結塊的細胞碎片落到試管底部。避免結塊漂起，將細胞懸液轉移到一個新的50 ml試管中進行洗滌步驟。

5.離心洗滌細胞，倒出上清液。重新懸浮在新鮮培養基中，并重復一次洗滌步驟。

6.  再次檢測細胞活力，并將細胞數量調整到ELISpot檢測所需的適當水平。

溫馨提示：本文中的實驗步驟僅供參考，實驗時請按照產品說明書操作。

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