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CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入門
Kit v4 - Manual v4.0
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第一天
第一部分：CUT&RUN緩沖液的制備（約30分鐘）
1. 按下表所述配制緩沖液。
注意：應根據完整手冊附錄1.1中的說明，根據細胞類型優化Digitonin（洋地黃皂苷） 的用量。
緩沖液名稱 | 組分 | 1 RXN | 8 RXN | 16 RXN | 保存 |
Wash Buffer | Pre-Wash Buffer | 1.8 mL | 14.4 mL | 28.8 mL | 室溫，供第一天使用 |
25× Protease Inhibitor | 72 μL | 576 μL | 1.15 mL | ||
1M Spermidine | 0.9 μL | 7.2 μL | 14.4 μL | ||
Cell Permeabilization Buffer | Wash Buffer | 1.4 mL | 11.2 mL | 22.4 mL | 4℃，供第2天使用 |
5% Digitonin | 2.8 μL | 22.4 μL | 44.8 μL | ||
Antibody Buffer | Cell Perm. Buffer | 100 μL | 800 μL | 1.6 mL | 冰上，供第1天使用 |
0.5M EDTA | 0.4 μL | 3.2 μL | 6.4 μL |
注意：以下流程皆按單個樣本計算，請根據實際樣本數量等比例配制
。
第二部分：ConA磁珠活化（約30分鐘）
2. 輕輕重懸ConA磁珠，取11 µL至1.5 mL離心管中。
3. 將離心管放在磁力架上，使溶液澄清；用移液器去除上清液。
4. 從磁力架上取下離心管。立即加入100 μL冷的Bead Activation Buffer，并用移液器將磁珠充分重懸。將離心管放回磁力架，使溶液澄清，用移液器去除上清液；此步驟重復一次。
5. 加入11 µL冷的Bead Activation Buffer重懸磁珠。
6. 按照10 µL/管的量，將磁珠等分到8聯排管中；置于冰上。
第三部分：細胞與活化磁珠結合（約30分鐘）
7. 計數起始細胞并確認其完整性和活力。每樣本使用500,000個細胞（可多加10%）。
8. 室溫下以600×g的轉速離心3分鐘，用移液器去除上清液。
9. 用100 µL的Wash Buffer重懸細胞。室溫下以600×g的轉速離心3分鐘，用移液器去除上清液；此步驟重復一次。
10. 用105 µL的Wash Buffer重懸細胞。對制備好的細胞進行計數并檢查其完整性。
11. 將 100 µL 細胞轉移到含有10 µL 活化 ConA 磁珠的8聯排管中。輕輕渦旋重懸，短暫快速離心，將磁珠收集到管底部。
12. 室溫孵育10分鐘，使細胞吸附到磁珠上。
13. 如果使用多通道移液器，請將試劑槽置于冰上，注入冷的Antibody Buffer。注意：一次取出并更換一條8聯排管的緩沖液，以避免 ConA 磁珠變干和樣品丟失。
14. 將離心管放在磁力架上，使溶液澄清，用移液器去除上清液。保存10 µL上清液用于臺盼藍染色，以確定上清液中沒有細胞（可依據完整手冊附錄1.2）。
15. 從磁力架上取下離心管。立即加入50µL冷的Antibody Buffer并用移液器吹吸重懸。取 10 µL重懸樣品以確認細胞結合到了ConA磁珠上（可依據完整手冊附錄1.2）。
第四部分：抗體結合（約30min +過夜）
16. 瞬時離心K-MetStat Panel原液并用移液器吹吸混勻（切勿渦旋）。在指-定用于H3K4me3和IgG對照抗體的反應中，加入2 µL K-MetStat Panel并渦旋混勻。注意：如果使用的細胞數少于500000個，請按照完整手冊第16頁的說明減少K-MetStat Panel的量。
17. 每個樣品加入0.5 µg抗體。對于指-定的對照反應，加入1µL IgG或H3K4me3對照抗體。輕輕渦旋混勻。
18. 在4oC條件下，置于旋轉混勻儀（nutator）上孵育過夜，管蓋稍稍抬高。切勿翻轉離心管。
第二天
第五部分：pAG-MNase結合（約40 min）
19. 將試劑槽放在冰上，注入冷的Cell Perm. Buffer。
20. 將離心管從4℃條件下取出，瞬時離心收集液體。注意：磁珠過夜可能沉淀，屬正常現象。
21. 將離心管置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。
22. 將離心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步驟重復一次。
23. 從磁力架上取下離心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer，輕輕渦旋混勻。注意：磁珠在這個階段可能會結塊，可用移液器輕柔吹吸，使結塊分散。
24. 每管加入2.5µL pAG-MNase。輕輕旋渦或用移液器吹吸，以重懸磁珠并使酶均勻分布。
25. 室溫孵育10分鐘。
26. 瞬時離心后，置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。
27. 將離心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步驟重復一次。
28. 從磁力架上取下離心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer。用移液器輕輕吹吸混勻、分散團塊。
第六部分：目標染色質片段化（約3小時）
29. 將離心管置于冰上。每管加入1 μL 100 mM的氯化鈣，輕輕渦旋或用移液器吹吸均勻。
30. 將離心管（管蓋略微抬高）放在旋轉混勻儀上4oC孵育 2 小時。
31. 制備終止液：取1µL E. coli Spike-in DNA與33µL Stop Buffer混合（單個反應用量）。輕輕旋渦混勻。注意：如果使用的細胞數少于500,000個，請按照完整手冊附錄2中的說明稀釋E. coli Spike-in DNA。
32. 孵育結束后，向每個反應中加入34 μL終止液，輕輕旋渦混勻。
33. 將反應離心管置于37℃熱循環儀中，孵育10分鐘。
34. 瞬時離心后，置于磁力架上，使溶液澄清。將含有DNA富集產物的上清液轉移到新的8聯排管中。丟棄含有ConA磁珠的離心管。
第七部分：DNA純化（約30分鐘）
35. 用無水乙醇（EtOH）和分子生物學級別的水制備85%乙醇（EtOH）（現用現配）。
36. 重懸SPRIselect試劑（Beckman Coulter, Inc），向每個反應管中緩慢加入119 µL。
37. 輕輕旋渦混勻，瞬時離心以收集液體。室溫孵育5分鐘。
38. 將離心管放在磁力架上2-5分鐘。用移液器去除上清液，不要用移液管吸頭攪動磁珠。
39. 將離心管保留在磁力架上。每管加入 180 µL 85% EtOH，用移液器去除上清液；此步驟重復一次。
40. 瞬時離心，管蓋朝內，使磁珠留在離心管一側。將離心管放回磁力架上，去除殘留的EtOH。
41. 從磁力架上取下離心管，打開管蓋。室溫風干磁珠2-3分鐘或直到液體蒸發，但磁珠仍然呈現潮濕的啞光棕色。如果磁珠有裂紋或呈淺棕色，說明過于干燥。
42. 每管加入17 µL 0.1X TE buffer洗脫DNA。
43. 渦旋重懸磁珠，室溫孵育2分鐘。
44. 將離心管置于磁力架上2分鐘。將15µL CUT&RUN DNA轉移到新的8聯排管中。
45. 使用Qubit熒光儀對1 μL DNA進行濃度測定。繼續文庫制備或將DNA保存在-20oC。
關于預期結果，可參閱完整手冊。切勿使用TapeStation/Bioanalyzer檢測 CUT&RUN DNA。DNA的產量太低，無法在這些平臺上進行檢測，而且在實驗步驟的這一步也無法提供有用的信息。可等到文庫制備后再檢查片段分布。
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