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Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

更新時間:2024-10-17   點擊次數:968次

Funakoshi品牌的FAOBlue是一款可通過熒光成像將活細胞內脂肪酸β-氧化(FAO)活性可視化的試劑。只需將產品添加到培養基中,即可通過熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。


FAO(脂肪酸β-氧化,Fatty acid beta-oxidation)

脂肪酸(FA)是多種脂質的基本成分,是細胞的重要組成部分,同時也是能量的主要來源之一。FA降解的主要途徑是通過線粒體脂肪酸β-氧化(FAO)。FAO 是肝臟、心臟和骨骼肌等器官能量平衡的關鍵代謝途徑。

FAO是一個復雜的生化過程,涉及多種酶的參與。FAO主要分為以下四個步驟:

1) 脫氫:脂酰-CoA 被酰基CoA脫氫酶氧化成烯酰基-CoA;

2) 水合:烯酰-CoA-被烯酰-CoA水合酶合成-3-羥基乙酰-CoA;

3) 氧化:3-羥基乙酰-CoA轉化為 3-酮酰-CoA;

4) 硫解:3-酮酰-CoA轉化為酰基-CoA(Cn-2)和乙酰-CoA。乙酰-CoA進一步轉化為ATP。生成的酰基-CoA(Cn-2)進入另一個FAO循環,進一步生成酰基-CoA(Cn-4)。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

研究表明,FAO代謝異常與肥胖和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等多種疾病密切相關,因此檢測FAO活性對于診斷相關疾病至關重要。但由于FAO過程較為復雜,使得在活細胞中檢測FAO活性的方法非常有限。目前只有一些間接方法,如使用含放射性同位素的脂肪酸或測量耗氧量。

FAOBlue作為首-款直接測量活細胞中FAO活性的試劑,只需在培養基中加入FAOBlue,即可通過熒光成像,簡單地檢測出活細胞中FAO的活性。

FAOBlue原理

FAOBlue是一種具有被乙酰氧甲基酯保護的壬酸(C9)的香-豆-素染料。在被FAO代謝之前,FAOBlue在405 nm下不會激發熒光。FAOBlue的乙酰氧基甲酯可被細胞內的酯酶水解,使FAOBlue可直接穿透細胞膜進入細胞,轉化為游離脂肪酸(Free FA type);Free FA type會轉化為Acyl-CoA,并進入FAO循環;Acyl-CoA 經過3次FAO循環分解為含有丙酸(C3)的非熒光香-豆-素。經過第4次FAO循環后,香-豆-素染料從丙酸中釋放出來并擴散到整個細胞。此時整個細胞內的香-豆-素在405 nm下發出強烈的藍色熒光,可視化地定量檢測細胞中FAO的活性。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑


產品信息

產品貨號

產品名稱

規格

分子式

分子量

溶解性

FDV-0033

FAOBlue (Fatty Acid Oxidation Detection Reagent)  /欣博盛生物

0.2 mg

C24H31NO9

477.51 g/mol

可溶于DMSO


產品特點

操作簡單,加入培養基后,孵育30-120min即可觀察熒光;

實例驗證適用于多種細胞類型。

產品應用

FAO活性的相對定量

評估藥物對FAO活性的影響

實驗步驟

使用前請先按照說明書中的Reconstitution步驟,用DMSO對FAOBlue試劑進行溶解,制成Stock solution,按照說明書中的要求保存。

以下實驗步驟僅供參考,請按照產品說明書操作:

1、在新鮮的HEPES緩沖液(HBS)中加入FAOBlue(最終濃度為5-20μM);

注:可用無血清培養基代替HBS

2、去除培養基,用HBS清洗細胞2次;

3、向細胞中加入含FAOBlue的HBS;

4、在37℃下培養30 min以上;

注:不同細胞類型最佳培養時間有所不同,建議根據具體情況而定。

5、用HBS清洗細胞;

6、通過成像觀察活細胞中的藍色熒光(Ex. 405 nm/Em. 430~480 nm)。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

成像指南

激光共聚焦顯微鏡:使用顯微鏡中配備的405 nm激光

落射熒光顯微鏡:激發濾光片非常重要,建議使用波長為 390-450 nm的激發濾光片


應用實例

一、FAOBlue及其香-豆-素衍生物的吸收光譜和熒光光譜

在PBS緩沖液(pH 7.4)中,FAO代謝后釋放的FAOBlue和香-豆-素衍生物的吸收光譜(左)、熒光光譜(右)。

FAOBlue經過FAO轉化為香-豆-素衍生物后,吸收峰從FAOBlue發生偏移至405 nm。因此,在405 nm的激發條件下,FAOBlue不會發出熒光,只有在通過FAO釋放香-豆-素衍生物時才會發出藍色熒光。

注:FAOBlue在300-380 nm(最大350 nm)激發時顯示藍色熒光(灰色線,370-450 nm),所以在選擇濾光片時請格外注意,避免同時激發未反應的FAOBlue以及FAO反應后的香-豆-素衍生物。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑


二、各種癌細胞中FAO活性可視化

在4種癌細胞中加入FAOBlue,培養一定時間后進行熒光觀察。所有細胞都出現藍色熒光,而經過FAO抑制劑etomoxir處理后藍色熒光顯著減少。這些數據表明,藍色熒光是由活細胞中FAO活性引起的。(注:實驗條件根據細胞類型不同而不同)

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

HepG2 : 5 μM, 30 min、 LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min


三、藥物對FAO活性的干擾

對HepG2細胞分別進行AICAR(通過 AMPK 激活的 FAO 激活劑)和ranolazine(部分 FAO 抑制劑)處理,隨后加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結果顯示,與對照細胞(未處理)相比,AICAR處理后明顯增加藍色熒光強度,ranolazine處理后則明顯降低藍色熒光強度。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑


四、藥物對FAO活性影響的定量分析

將HepG2細胞與不同濃度的ND630預孵育4小時。ND630處理后,加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結果表明,伴隨ND630濃度增加,藍色熒光強度隨之增加。由此可知,ND630可增強FAO活性。(注:ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制劑,被認為是治療非酒精性脂肪肝(NAFLD)的潛在藥物)

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

五、NASH模型小鼠的FAO活性分析

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種與脂質相關的疾病,表現為脂肪酸代謝活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強脂質代謝的bezafibrate后,提取原代肝細胞。向各組細胞加入FAOBlue(5 μM)觀察其FAO活性,結果顯示,相較正常小鼠來源細胞,NASH模型小鼠來源細胞的FAO活性明顯被抑制。另外,給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來源細胞中FAO活性被恢復。

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性熒光定量試劑

產品文獻

Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.

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