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腺相關(guān)病毒 (AAV) 是基因治療中使用最-廣泛的傳遞機(jī)制。近年來，基于AAV病毒所開發(fā)的基因療法的研發(fā)及臨床試驗(yàn)注冊(cè)數(shù)量也呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。截止本文撰寫之時(shí)，美國食品和藥物管理局已批準(zhǔn)五項(xiàng)AAV療法，也是全球市場(chǎng)上最為昂貴的藥物，其中售價(jià)最高的Hemgenix®，每劑約為350萬美元。由于該療法每劑量可能需要1011-1016病毒載量，如何實(shí)現(xiàn)高效的AAV生產(chǎn)，已成為工藝流程優(yōu)化中的重要一環(huán)。
在病毒生產(chǎn)工藝方面，除了需要克服細(xì)胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙，以實(shí)現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低細(xì)胞毒性；增強(qiáng)子的加入，可大幅度提升多種血清型AAV病毒生產(chǎn)載量。但Mirus并沒有止步于此，為了進(jìn)一步提高下游生產(chǎn)中的AAV病毒基因組產(chǎn)量， 今年七月底Mirus發(fā)布用于AAV生產(chǎn)的RevIT™ AAV Enhancer，可搭配Mirus TransIT-VirusGEN® GMP 轉(zhuǎn)染試劑或其他品牌轉(zhuǎn)染試劑 (PEI)。基于HEK293懸浮細(xì)胞數(shù)據(jù)，相對(duì)于老版本AAV生產(chǎn)，RevIT™ AAV Enhancer可提高AAV基因組滴度1.2-4.9倍，并且便于使用，很容易整合入現(xiàn)有AAV生產(chǎn)工藝工作流程中。Mirus RevIT™ AAV Enhancer的推出，使得AAV上產(chǎn)上游成本進(jìn)一步降低成為可能，降低了基因治療單劑量成本。
● RevIT™ AAV Enhancer：可1.2-4.9X提升AAV病毒基因組滴度
平行對(duì)比Mirus TransIT-VirusGEN®搭配老版本AAV增強(qiáng)子(VirusGen + Enh 1.0)以及新版本RevIT™ AAV Enhancer (VirusGen + RevIT)，針對(duì)不同血清型 AAV2、AAV8、AAV9，AAV基因組滴度分別有著1.6、4.9以及1.2倍提升。除此之外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在測(cè)試的所有血清型中，使用RevIT™ AAV Enhancer也在不同程度上得到更高比例的實(shí)心率 (圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在搭配Mirus TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，可顯著提高病毒基因組滴度(GC/mL)及實(shí)心率(%Full Capsids)。
?圖1. 在加入RevIT™ AAV Enhancer后，相比Mirus老版本增強(qiáng)子，可1.2-4.9X提升AAV基因組拷貝數(shù)，改善AAV病毒實(shí)心率。
● RevIT™ AAV Enhancer：具有廣泛適配性，可搭配其他品牌轉(zhuǎn)染試劑（PEI），AAV病毒基因組滴度有著顯著提升
平行測(cè)試兩個(gè)品牌轉(zhuǎn)染試劑：Polyplus FectoVIR® 病毒轉(zhuǎn)染試劑(“Polymer F")以及Polyplus PEIpro®病毒轉(zhuǎn)染試劑(“Polymer P")，在加入Mirus RevIT™ AAV Enhancer，針對(duì)不同血清型AAV2、AAV8、AAV9，AAV基因組滴度分別有著1.7-2.0x、1.7-2.2x、2.2-2.3x提升(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在搭配其他品牌病毒轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，Mirus RevIT™ AAV Enhancer可顯著提高AAV病毒基因組滴度(GC/mL)。
?圖2. “Polymer F"以及“Polymer P"病毒轉(zhuǎn)染試劑，在搭配Mirus RevIT™ AAV Enhancer，針對(duì)不同血清型，其AAV病毒基因組滴度都有著顯著提升。
● RevIT™ AAV Enhancer：具有廣泛的適配性，可適用于不同培養(yǎng)基體系
TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑搭配RevIT™ AAV Enhancer，在不同類型病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基中，具有很好的兼容性。測(cè)試使用293-VP 2.0細(xì)胞，搭配培養(yǎng)基類型包括VPM (Thermo Fisher) 及 BalanCD HEK 293 (Irvine Scientific)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針對(duì)不同血清型AAV2、AAV5、AAV8、AAV9，RevIT™ AAV Enhancer在不同培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)條件下，AAV病毒基因組滴度提升方面并無顯著差異。
?圖3. 更換不同品牌病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基，AAV病毒基因組滴度的增加無顯著差異。
● RevIT™ AAV Enhancer：實(shí)驗(yàn)流程靈活性，不同加入時(shí)間窗口有著近似表現(xiàn)
為了進(jìn)一步確定加入RevIT™ AAV Enhancer可有效提高AAV病毒基因組載量，是否需要嚴(yán)格把控加入時(shí)間窗口。平行測(cè)試不同加入時(shí)間點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)染前30或60分鐘、轉(zhuǎn)染時(shí)及轉(zhuǎn)染后。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照，在加入RevIT™ AAV Enhancer不同測(cè)試時(shí)間點(diǎn)， AAV8病毒基因組滴度都有穩(wěn)步的提升(2倍)，并且病毒實(shí)心率穩(wěn)定保持在相同水平。該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RevIT™ AAV Enhancer加入時(shí)間點(diǎn)的靈活性，一定程度上簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工作流。
?圖4. RevIT™ AAV Enhancer加入時(shí)間點(diǎn)的靈活性
● 實(shí)驗(yàn)tips：如何進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染試劑評(píng)估？什么是病毒載量？如何檢測(cè)？
更多詳細(xì)信息，請(qǐng)查看Technical Resources中Virus Titer Reference Card
? 相關(guān)產(chǎn)品信息
| 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) | 鏈接 |
| RevIT™ AAV Enhancer | 1.5 ml | MIR 8000 | link |
| 10 x 1.5 ml | MIR 8006 | ||
| VirusGEN® AAV轉(zhuǎn)染試劑及RevIT™ AAV Enhancer | For 1L of Culture | MIR 8007 | |
| For 10L of Culture | MIR 8008 | ||
| TransIT-VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑 | 0.3 ml | MIR 6703 | link |
| 0.75 ml | MIR 6704 | ||
| 1.5 ml | MIR 6700 | ||
| 5 x 1.5 ml | MIR 6705 | ||
| 10 x 1.5 ml | MIR 6706 | ||
| 30 ml | MIR 6720 | ||
| TransIT-VirusGEN® GMP級(jí)別轉(zhuǎn)染試劑 | 150 ml | MIR 6845-GMP | link |
| VirusGEN® AAV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 kit for 1 L of cell culture | MIR 6750 | link |
| VirusGEN® GMP級(jí)別AAV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 Kit - for 50 L of cell culture | MIR 6815-GMP | link |
| VirusGEN® LV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 kit for 1 L of cell culture | MIR 6760 | link |
| VirusGEN® GMP級(jí)別LV轉(zhuǎn)染試劑(套裝) | 1 Kit - for 50 L of cell culture | MIR 6825-GMP | link |
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